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Le criblage automatisé permet d’évaluer l’activité d’un grand nombre de composés chimiques ou naturels sur des cibles biologiques (macromolécules, cellules, organes, tissus, animaux). Il nécessite le développement d’essais miniaturisés et leur automatisation sur une plateforme robotique.

Miniaturisation d'essais

Nous proposons un accompagnement et une étude préalable de faisabilité pour miniaturiser les essais afin de les rendre compatibles avec la technologie du criblage à haut débit tout en réduisant les coûts et en augmentant leur robustesse statistique.

Les essais sont miniaturisés au format de microplaques (96 ou 384 puits le plus souvent) et la procédure expérimentale est adaptée afin de permettre le traitement des échantillons par des robots de pipetage et de réaliser le criblage d’un grand nombre de composés (seuls ou en combinaison). Les effets biologiques sont quantifiés par diverses mesures de fluorescences, luminescence, radioactivité ou imagerie.

Demande de projet
Criblages moléculaires sur cibles purifiées (« Target-based »)

Les criblages moléculaires sur cibles purifiées visent typiquement à (1) modifier des interactions entre des cibles biologiques ou (2) modifier l’activité d’une cible biologique (enzyme par exemple).

 

1)     Exemples de tests d’interactions :

  • Nature du test :
  • Interactions protéine-protéine
  • Interactions protéine-acide nucléique
  • Interactions entre protéines solubles et ligands
  • Tests de radioactivité

  • Technologie :
  • Tests d’interaction par mesure en fluorescence, anisotropie
  • Recherche de ligands de protéines orphelines (fluorescence)
  • Tests d’interaction alpha-screen, HTRF, FRET, TRF, FP, etc.
  • Mesure d’interaction protéine-ligand label-free

 

2)     Exemples de tests fonctionnels

  • Nature du test :
    • Enzymes diverses (protéases, kinases, phosphatases, methyl transférases, enzymes virales etc…)
    • Interactions protéine-protéine/agrégation fonctionnelle

  • Technologie :
  • Absorbance (colorimétrie),  fluorescence, luminescence ou en radioactivité

Demande de projet
Criblages phénotypiques sur cellules ou organismes vivants (« Phenotypic-based »)

Les criblages phénotypiques visent à modifier un phénotype sans nécessairement connaître la cible biologique responsable de ce phénotype.

Ils sont principalement réalisés sur des cellules vivantes ou fixées en utilisant, soit :

  1. une mesure globale de fluorescence, luminescence, etc… puits à puits grâce à des lecteurs multimodes de microplaques permettant un criblage à haut débit (HTS),
  2. des mesures utilisant des technologies sans marquage (DMR, impédance,…),
  3. l’acquisition d’images par microscopie automatisée et la mesure de paramètres cellulaires, cellule à cellule, à haut contenu en information (High Content Screening/Analysis/Screening HCS/HCA) grâce à des marqueurs fluorescents ou par contraste de phase, etc). La technologie HCS et principalement utilisée si le phénotype étudié nécessite une visualisation des sous-structures cellulaires (compartiments, organelles, noyau, cytosquelette, …) et permet un moyen ou haut débit avec une miniaturisation en plaques 96 ou 384 puits.

Les cribles phénotypiques peuvent également être réalisés sur des organismes vivants unicellulaires (bactérie, levure, champignon) à haut débit, ou sur des organismes vivants complexes (nématode, ascidie, drosophile, poisson zèbre,…) à des débits adaptés à chaque organisme.

A titre d’exemple, les essais phénotypiques sur cellules vivantes ou fixées en HTS ou HCS disponibles sont listés ci-dessous. De nouveaux tests personnalisés peuvent être développés en collaboration avec l’infrastructure (cf « Miniaturisation d’essais ») :

  • Survie cellulaire, prolifération, apoptose, nécrose, mitose
  • Expression de gènes rapporteurs
  • Quantification et/ou visualisation de l’expression de biomarqueurs
  • Migration cellulaire
  • Blessure cellulaire, cicatrisation
  • Trafic cellulaire, autophagie
  • Remodelage du cytosquelette
  • Mesure de l’effet de ligands sur cellules (label-free)
  • Mesure de seconds messagers (AMPc, IP1, calcium…)
  • Mesure de potentiels membranaires
  • Mesures de protéines excrétées (chimiokines, cytokines, etc)
  • Réplication virale, bactérienne

Demande de projet
Survie cellulaire, prolifération, apoptose, nécrose, mitose

Evaluation des effets cytotoxiques d’un composé

Introduction

L’étude de la cytotoxicité d’un composé ayant une activité modulatrice sur la réponse des cellules est essentielle.

Elle permet de vérifier que la molécule active n’induit aucune modification  de la viabilité cellulaire par rapport aux cellules non traitées.

Plusieurs lignées cellulaires sont disponibles pour l’étude de la cytotoxicité

Principe

Plusieurs tests de viabilité cellulaire sont proposés

1.  Test MTT

Le test est basé sur le clivage par la succinate   deshydrogénase mitochondriale d’un sel de   tétrazolium de couleur jaune en cristaux de   formazan de couleur bleue.




La réaction est quantifiée par mesure de l’absorbance à 560 nm des cristaux solubilisés

dans un solvant organique qui est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.

2.  Test WST-1   www.ozyme.fr

Le test est basé sur le clivage par la succinate   deshydrogénase mitochondriale d’un sel de   tétrazolium de couleur rouge en cristaux de   formazan de couleur jaune.   La réaction est quantifiée par mesure de l’absorbance à 450 nm   des cristaux solubles dans le milieu de culture qui est   proportionnelle au nombre de cellules vivantes.


A la différence du MTT, le WST-1 est un sel de tétrazolium capable d’être clivé par les cellules vivantes en formazan soluble, il n’y a donc pas d’étape de solubilisation ultérieure dans un solvant organique.

3.  Test Cell Titer Glo Luminescent (PROMEGA)  www.promega.com


Le test est basé sur la mono oxygénation de la luciférine en oxyluciférine par la luciférase en présence de Mg 2+ et d’ATP La réaction est quantifiée par mesure du signal luminescent qui est proportionnel à l’ATP présent dans le milieu et donc à l’activité métabolique des cellules.

4. IncuCyte (ESSEN BIOSCIENCE) www.essenbioscience.com

Cet appareil permet de, réaliser des cinétiques de la prolifération cellulaire dans   des conditions de  culture classiques  sous atmosphère contrôlée en   quantifiant la confluence des cellules.


Protocole

Format: 96 ou 384 puits

Ensemencement des cellules 24H avant traitement

Molécule de référence : Chlorpromazine

Incubation 48H à 37°C (possibilité d’adapter le temps d’incubation au modèle biologique)

Réalisation du test de viabilité cellulaire


Evaluation de la cytotoxicité de la Chlorpromazine sur HepG2  (ATCC HB-8065)


IncuCyte (ESSEN BIOSCIENCE)


Demande de projet
Expression de gènes rapporteurs

<à compléter>

Demande de projet
Quantification et/ou visualisation de l’expression de biomarqueurs

<à compléter>

Demande de projet
Migration cellulaire

<à compléter>

Demande de projet
Blessure cellulaire, cicatrisation

<à compléter>

Demande de projet
Trafic cellulaire, autophagie

<à compléter>

Demande de projet
Remodelage du cytosquelette

<à compléter>

Demande de projet
Mesure de l’effet de ligands sur cellules (label-free)

Mesure de la liaison récepteur-ligand sur cellules entières sans marquage

Introduction

Le test cellulaire Label Free, issu de la technologie Corning Epic®, permet de mesurer les changements phénotypiques des cellules entières suite à un stimulus engendrant une redistribution dynamique de masse de la cellule (DMR) .

www.corning.com


La redistribution dynamique de masse de la cellule en réponse à un stimulus a lieu dans la majorité des évènements biologiques, et sa mesure peut être réalisée dans le cadre de nombreuses applications, comme la liaison d’un ligand, l’activation ou l’inhibition d’un récepteur,  le recrutement intracellulaire, la cytotoxicité, l’infection virale, l’endocytose, le chimiotactisme…

Principe

Les cellules sont ensemencées dans des plaques au fond desquelles sont disposés des biosenseurs optiques. Le fond de la plaque est éclairé par de la lumière large bande, et la redistribution de masse des cellules suite à un stimulus engendre une modification de l’indice de réfraction de la monocouche cellulaire. Ce changement d’indice est détecté par les biosenseurs, et se traduit par une variation en pm (picomètres) de longueur d’onde de la lumière réfractée.

www.corning.com



Protocole

A adapter en fonction de l’essai Format : 384 puits Cellules  :  cellules adhérentes

  1. Les cellules sont ensemencées dans la plaque
  2. Incubation 1 nuit à 37°C 5% CO2
  3. Lecture de la ligne de base
  4. Traitement Lecture de la réponse cellulaire

Mesure de DMR sur cellules HEK surexprimant le récepteur de l’ocytocine

1) Mesure de l’effet agoniste de l’ocytocine

Format : 384 puits

Cellules  :  HEK293 surexprimant le récepteur de l’ocytocine


2) Mesure de l’effet antagoniste du L-368,899

Format : 384 puits

Cellules  :  HEK293 surexprimant le récepteur de l’ocytocine

En présence de 30 nM d’ocytocine

Demande de projet
Mesure de seconds messagers (AMPc, IP1, calcium…)

Mesure de l’AMPc intracellulaire

Introduction

L’ adénosine 3’, 5’-monophosphate cyclique (AMPc) est un des plus importants seconds messagers, intervenant dans les réponses physiologiques de neurotransmetteurs, hormones et médicaments.

L’ AMPc est produit à partir d’adénosine triphosphate (ATP) par l’adénylate cyclase membranaire. La régulation de la concentration intracellulaire en AMPc est contrôlée par l’équilibre entre sa synthèse à partir d’ATP et sa dégradation rapide en 5'-AMP par une phosphodiestérase (PDE).

Certains récepteurs RCPG peuvent contrôler la production d’AMPc en agissant via l’activation de protéines G spécifiques, capables de stimuler (Gs) ou d’inhiber (Gi) sa production.

La mesure de l’AMPc intracellulaire est donc une méthode permettant de mesurer l’effet de composés sur certains RCPG.

Principe

L'essai est basé sur la compétition entre l’AMPc traceur marqué avec l'europium et l’AMPc de l’échantillon pour la liaison sur à des anticorps anti-cAMP marqués avec le colorant ULight™. En l’absence d’AMPc libre, les anticorps se lient à l’AMPc traceur, l’énergie émise par l’europium excité à 320 ou 340nm est transférée par FRET aux molécules ULight™ qui émettent à 665nm, le signal TR-FRET est maximal. En présence d’AMPc libre, il y a compétition pour la liaison aux anticorps, le signal TR-FRET est donc diminué.


Protocole

Format : 384 puits

Cellules : HEK293 en suspension (possibilité de travailler sur d’autres cellules)

Récepteur : RCPG couplé Gαs

  1. Distribution des cellules dans la plaque
  2. Stimulation avec les composés d’intérêt
  3. Ajout des solutions d’AMPc traceur et d’anticorps anti-AMPc-ULight™
  4. Mesure  

Longueur d’onde d’excitation : 320 nm

Longueur d’onde d’emission 1 : 615 nm

Longueur d’onde d’emission 2 : 665 nm


Stimulation du récepteur à la vasopressine et mesure du signal AMPc associé

Format : 384 puits

Cellules  : HEK293 surrexprimant le récepteur à la vasopressine AVPR2




Dosage de l’IP1 intracellulaire

Introduction

La détection des seconds messagers intracellulaires comme l’IP1, produit suite à l’activation des récepteurs couplés aux protéines Gq, peut être réalisée par la technologie HTRF®.

La technologie HTRF® (http://www.cisbio.com/) repose sur le principe de base du FRET.  Les propriétés des fluorophores utilisés apportent de nombreux avantages.

Principe

Il s’agit d’un test de compétition pour la liaison à un anticorps anti-IP1 lié au fluorophore donneur, entre d’une part l’IP1 intracellulaire et d’autre part l’IP1 apporté par le kit fusionné au fluorophore accepteur.

Du LiCl est ajouté dans le tampon de réaction pour permettre l’accumulation de l’IP1 produit dans les cellules.