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Pour augmenter le succès de la découverte de candidats médicaments ou d’outils de recherche, il est nécessaire de considérer l’activité pharmacologique des composés et l’optimisation de leurs propriétés ADMET : Absorption, Distribution, Métabolisme, Excrétion et Toxicité.

Nos plateformes d’ADMET proposent une palette de prestations permettant d’identifier et de développer des candidats précliniques. Les tests peuvent être classés en quatre catégories : caractérisation physicochimique, ADME in vitro, pharmacocinétique in vivo et toxicité.

Caractérisation physico-chimique

Le profil physicochimique des composés comprend les tests suivants.

 

-        Solubilité (thermodynamique, cinétique)

-         Lipophilie (log P, log D, CHI)

-         pKa

-         Stabilité chimique dans des tampons et des milieux simulés (gastrique, intestinal)

-         Développement de formulations pour les études in vivo

Demande de projet
Tests in vitro (absorption, métabolisme)

Pour limiter l'utilisation d'animaux des modèles in vitro ont été développés pour la prédiction des paramètres ADME à partir de tests rapides et simples à mettre en œuvre.

 

-        Modèles de perméabilité intestinale (PAMPA, Caco-2, inhibition des P-gp)

-         Liaison aux protéines plasmatiques

-         Stabilité métabolique (plasma, microsomes de foie, fraction S9 du foie, hépatocytes, enzymes recombinantes, conjugaison au glutathion ou à l’acide glucuronique, sulfatation)

-         Barrière hémato-encéphalique (BHE)

-         Identification des métabolites

-         Interactions médicamenteuses (inhibition des CYP 450, induction des CYP 450)

Demande de projet
Tests in vivo (distribution , élimination)

Nous évaluons l’ensemble des propriétés pharmacocinétiques chez l’animal. La connaissance du comportement pharmacocinétique d'un composé est un pré-requis nécessaire à son utilisation raisonnée en expérimentation in vivo.

 

-        Pharmacocinétique chez le rongeur (détermination de Cmax, Tmax, t1/2, clairance, volume de distribution, AUC)

-        Biodisponibilité (i.v., i .p., i.m., p.o., topique, s.c….

-        Biodistribution (tous tissus)

-        Passage de la barrière hémato-encéphalique

-        Elimination dans l’urine, la bile, les fécès…

Demande de projet
Toxicité

L’évaluation de la toxicité d’un composé est essentielle avant d’entreprendre des études chez l’animal. Il est également important d’étudier la cytotoxicité d’un composé afin de vérifier qu’il n’induit aucune modification de la viabilité cellulaire.

 

-        Étude d’innocuité chez le rongeur

-        Tests de viabilité cellulaire

Demande de projet
Pharmacocinétique souris

Introduction

Connaître le comportement pharmacocinétique d'un composé est un pré-requis nécessaire à son utilisation raisonnée en expérimentation in vivo, l'interprétation des résultats pharmacologiques et la conception des études de toxicologie.

Suite à l’administration d’un composé, sa concentration plasmatique va évoluer avec le temps.

Des échantillons de sang et/ou de tissus (en fonction de la demande du client) sont obtenus chez les animaux après l'administration du composé.

• L’exposition à un composé se détermine en mesurant l’aire sous la courbe concentration = f(temps) (AUC)

• La biodisponibilité se définit par le rapport des AUC : AUC (IV) / AUC (VO)


Protocole

Étude parallèle, protocole typique :

Animaux : souris CD-1       

8 temps et 2 voies d’administration : IV et VO

Dose unique, n=3 souris par temps

Collecte des échantillons de sang : ponction cardiaque (250 µM plasma/échantillon)

Détection : LC-MS/MS

Les données obtenues serviront à l’élaboration de courbes temps-concentration et à la détermination des paramètres pharmacocinétiques fondamentaux tels que T1/2, Cmax, Tmax...



Administration d’antipyrine en IV chez la souris

Notes

Pour d’autres conditions (animaux, temps, voie) prendre contact.

Référence

K. Cox et al (2002) Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening 5, 29-37

Demande de projet
Stabilité métabolique - fraction S9 de foie

Introduction

Le foie est le principal organe impliqué dans le métabolisme des médicaments.

Le métabolisme hépatique comprend 2 phases : la phase I correspond à des réactions d’oxydation catalysées par les cytochromes P450 tandis que la phase II consiste en des réactions de conjugaison au glutathion, à l’acide glucuronique, etc.

La fraction S9 de foie correspond au surnageant obtenu par centrifugation d’homogénat à 9000g. Elle contient les enzymes présentes dans les microsomes (cytochromes P450) ainsi que les enzymes solubles (glutathion transferase, glucuronyl transférase…).

• La fraction S9 permet d’avoir un modèle complet de métabolisme puisqu’elle contient la majorité des enzymes de phase I et II


Protocole

Le composé est incubé avec 1 mg/mL de S9 à 37°C en présence d’un ou plusieurs co-facteurs impliqués dans les réactions à étudier (NADPH, glutathion, acide glucuronique d’uridine diphosphate).

Ex : glutathion seul pour examiner une conjugaison directe au glutathion ou, glutathion + NADPH pour déterminer si une étape d’oxydation est nécessaire pour obtenir la conjugaison.

La concentration en composé est de 5 µM dans un tampon phosphate contenant du chlorure de magnésium.

5 incubations sont réalisées en parallèle et arrêtées à différents temps (ou 2 incubations). 0,15, 30, 45 et 60 min (ou 0 et 60 min).

Le pourcentage de composé restant est déterminé par LC-MS en mesurant l’aire sous le pic du composé sur le chromatogramme.

Contrôles : 0 µM de composé ; sans co-facteur ; contrôle positif avec composé standard.

Nombre de réplicats = 2


Stabilité de la Testostérone en présence de fraction S9 de foie humain

Notes

Pour d’autres conditions, prendre contact.


Référence

R. Singh et al (1996) Rapid communications in mass spectrometry 10, 1019-1026

N. Plant et al (2004) Drug Discovery Today 9, 328-336

Demande de projet
Stabilité métabolique - microsomes de foie

Introduction

Le métabolisme correspond à la transformation des composés dans l’organisme par voie enzymatique

Le principal organe impliqué dans ce processus est le foie.

Les microsomes sont une fraction subcellulaire d’homogénat de foie. Ils contiennent les enzymes liées à la membrane du réticulum endoplasmique  comme les cytochromes P450.

L’utilisation des microsomes est adapté à une étude avec un haut débit d’analyses (nombre important de composés)

• 60% des médicaments mis sur le marché sont métabolisés par les cytochromes P450

• Les microsomes sont préparés à partir de multiples donneurs pour éviter les effets de variabilité individuelle


Protocole

Le composé est incubé avec les microsomes (0,5 mg/mL) à 37°C en présence du co-facteur NADPH (1 mM).

La concentration en composé est de 5 µM dans un tampon phosphate contenant du chlorure de magnésium

5 incubations sont réalisées en parallèle et arrêtées à différents temps (ou 2 incubations). 0,15, 30, 45 et 60 min (ou 0 et 60 min).

Le pourcentage de composé restant est déterminé par LC-MS en mesurant l’aire sous le pic du composé sur le chromatogramme.

Contrôles : 0 µM de composé ; sans co-facteur ; contrôle positif avec composé standard.

Nombre de réplicats = 2


Stabilité du Vérapamil en présence de microsomes de foie humain


Notes

Pour d’autres conditions, prendre contact.


Référence

Obach et al (1997) The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283, 46-58

Linget et al (1998) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 19, 893-901

Demande de projet
Stabilité plasmatique

Introduction

Le sang et le plasma contiennent des enzymes pouvant hydrolyser certains type de groupements labiles tels que des esters ou des amides.

Il est important de déterminer la stabilité plasmatique d’une nouvelle molécule car les composés rapidement dégradés dans le plasma ont généralement une faible activité in vivo.

À l’inverse, dans le cas de "promédicaments", l’hydrolyse de groupements labiles permet d’augmenter l’activité pharmacologique.

• Les composés actifs localement et   rapidement dégradés en   molécules inactives sont appelés   "antemédicaments".

• La stabilité plasmatique d’un   composé peut être très variable   d’une espèce à une autre


Protocole

La stabilité est déterminée à 37°C.

Une dilution est réalisée à 5 µM dans du plasma (ou du sérum) à partir d’une solution stock à 10 mM dans le DMSO.

5 incubations sont réalisées en parallèle et arrêtées à différents temps (ou 2 incubations). 0,15, 30, 45 et 60 min (ou 0 et 60 min).

Le pourcentage de composé restant est déterminé par LC-MS en mesurant l’aire sous le pic du composé sur le chromatogramme.

Contrôles : 0 µM de composé ; contrôle positif avec composé standard.

Nombre de réplicats = 2


Stabilité de la propanthéline dans du sérum murin à 37°C

Notes

Pour d’autres conditions, prendre contact.


Référence

L. Di et al (2005) Journal of Biomolecular Screening 297, 110-119


Demande de projet
Lipophilie: log D (shake flask)

Introduction

Le coefficient de partage entre l’octanol et l’eau est le paramètre physicochimique le plus utilisé pour mesurer la lipophilie.

La lipophilie d’une molécule influence son absorption, sa distribution entre les tissus. Par ailleurs une molécule hydrophobe présente un risque élevé de liaison non spécifique aux protéines et de métabolisme par les cytochromes P450.

Le coefficient de partage appelé log P se réfère généralement aux molécules neutres. Il est préférable de déterminer le coefficient de distribution log D qui tient  compte de l’ionisation des molécules.

• Pour une absorption orale optimale, le log D doit se situer entre 0,5 et 2.

• La différence log Doctanol/eau - log Dcyclohexane/eau offre un bon modèle de perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.

Protocole

Le coefficient de partage est mesuré par la méthode dite du "flacon agité" : équilibrage d’un tampon aqueux (PBS) et d’un solvant organique non miscible (octanol). Une solution à 100 µM théorique est préparée dans ce mélange à partir d’une solution mère dans le DMSO à 10 mM. Plusieurs rapports volumiques de solvant et de tampon sont évalués pour couvrir une gamme de lipophilie allant de -1 à 3.

Incubation : 1h à température ambiante (≈20°C).

Détection HPLC UV-Vis (barrette de diodes).

La concentration dans la phase aqueuse est déterminée par HPLC. La concentration dans la phase organique est calculée à l’aide d’une référence (solution standard à 100 µM).

Nombre de réplicats = 2


Log D à pH=7,4 mesurés à température ambiante



Notes

Pour un autre pH, prendre contact.

Les valeurs de lipophilie mesurables sont comprises entre -1,5 et 3.

La méthode CHI (Chromatographic Hydrophobicity Index) permet d’atteindre des lipophilies plus élevées.


Références

A. Avdeef (2001) Current Topic in Medicinal Chemistry 1, 277-351

C. Young (1987) Journal of Medicinal Chemistry 31, 656-671

Demande de projet
Perméabilité - PAMPA

Introduction

La perméabilité est la vitesse de passage d’un composé à travers une barrière biologique.

Ce processus est impliqué dans l’absorption intestinale d’un composé mais également dans sa distribution du sang vers les organes tels que le foie, le cerveau ou le rein.

Le principal mécanisme intervenant pour la perméabilité d’un composé est la diffusion passive.

La méthode PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) offre un modèle in vitro de perméabilité passive.

• La barrière artificielle est constituée de phospholipides solubilisées dans un solvant organique

• La méthode est simple, peu coûteuse et rapide


Protocole

Le composé est dilué à 10 µM dans un tampon (PBS)

La mesure est réalisée en plaque 96 puits. Le système est composé d’une plaque standard et d’une plaque à fond poreux positionnée sur la première, ce qui permet de créer pour chaque puits un compartiment donneur et un compartiment accepteur.

Une solution de phosphatidylcholine à 2% dans du dodécane est introduite dans les puits à fond poreux du compartiment accepteur, ce qui permet de générer la membrane.

Le temps d’incubation est de 5 heures et la mesure est effectuée à température ambiante.

Détection HPLC UV-Vis ou LC-MS

Contrôles : Bilan de matière, intégrité de la membrane vérifiée à l’aide d’un colorant

Nombre de réplicats = 4


Perméabilités de composés standards mesurées à 22°C

Composé

Log Pe (cm/s)

Composé

Log Pe (cm/s)

Vérapamil

-4,42

Testostérone

-3.72

Propranolol

-4.78

L-Dopa

-7.02

Antipyrine

-6.13

Métoprolol

-6.38



Notes


La méthode PAMPA ne permet de modéliser que le mécanisme de diffusion passive. L’ensemble des mécanismes impliqués dans la perméabilité intestinale se retrouvent dans la méthode utilisant la lignée cellulaire Caco-2.



Référence


M. Kansy et al (1998) Journal of Medicinal Chemistry 41, 1007-1010

Demande de projet
pKa

Introduction

Le pKa ou constante d’ionisation est le paramètre indiquant la force des acides et des bases.

Il donne l’état d’ionisation et donc la charge d’une molécule à un pH donné. Selon son état de charge, les propriétés physiques, chimiques et biologiques d’une molécule sont différentes. Il est donc important de savoir prédire quelle forme ionique est présente au site d’action de la molécule.

La méthode traditionnelle permettant de mesurer le pKa est la potentiométrie. Elle présente pourtant de nombreux inconvénients : temps de mesure long, quantité de produit consommée importante, faible sensibilité et méthode non séparative.

La mesure du pKa se fait par électrophorèse capillaire . Cette méthode permet une détermination des pKa à haut débit. Du fait de sa sensibilité, la quantité de produit consommée est très faible. Les impuretés sont séparées du composé principal

• Un faisceau de 96 capillaires permet la mesure des pKa de 4 molécules simultanément sur 24 points de pH.

• La méthode de Yasuda-Shedlovsky est appliquée pour la détermination des pKa de molécules hydrophobes (utilisation d’un co-solvant et extrapolation à 0% de co-solvant.


Protocole

Les échantillons sont préparés à 250 µM dans un diluant acide ou basique selon la molécule avec 0,01% de DMSO (marqueur neutre). Les échantillons sont disposés sur une plaque 96 puits. 4 échantillons/plaque pour les composés hydrosolubles ou 1 molécule/plaque pour les composés hydrophobes (méthode des co-solvants : mesure à 30, 40, 50, 60% de MeOH puis extrapolation à 0%.

Détection UV (214 nm). Les capillaires sont conditionnés avec des tampons allant de pH 1,5 à 11,5 (24 points de pH). Les échantillons sont injectés simultanément.


pKa mesurés à 25°C sur 24 points de pH

Composé

pKa

Composé

pKa

Imipramine

9,36

4-aminipyridine

9,2

Procaine

2,11 ; 9,16

Acide benzoïque

4,10

Trichlorophénol

5,76

quinine

4,36 ; 8,61

Cimétidine

6,5

Acyclovir

2,13 ; 9,30

Notes

La méthode utilisée est différente selon que le composé soit hydrosoluble ou non, il est donc important de savoir si le composé ne précipite pas dans l’eau à 250 µM entre pH 1,5 et 11,5.


Références

X. Gong et al. (2008) Chromatographia. 68, 219-225

Demande de projet
Solubilité cinétique

Introduction

La méthode du flacon agité permet de déterminer une solubilité thermodynamique, c’est à dire de caractériser l’équilibre entre un composé sous forme solide et le tampon dans lequel il se dissout.

Dans certains cas, il n’est pas nécessaire d’avoir une telle information. La mesure d’une solubilité apparente suffit.

Les tests de criblages biologiques sont généralement réalisés à partir de chimiothèques de composés conditionnées en solution dans du DMSO.

Il est possible de déterminer une solubilité apparente à partir de ces solutions stock en les diluant dans un tampon aqueux.

• Cette méthode permet essentiellement de repérer les composés très peu hydrosolubles.

• Elle est plus rapide, moins chère qu’une mesure de solubilité thermodynamique.


Protocole

Une dilution à 200 µM dans un tampon hepes à pH=7,4 est préparée à partir d’une solution stock à 10 mM dans le DMSO. Ce mélange est équilibré à température ambiante pendant 24 heures.

Après centrifugation, le surnageant est injecté en HPLC (détection UV).

Une solution de référence est préparée en faisant une dilution identique dans un mélange CH3CN/eau 1/1 v/v. Un point de référence à 100 µM permet de vérifier la linéarité de la réponse UV.

La comparaison des chromatogrammes permet de déterminer la solubilité apparente des composés (si elle est inférieure à 200 µM)

Nombre de réplicats = 2


Solubilités apparentes à pH=7,4 mesurées à température ambiante

Composé

Solubilité (µM)

Composé

Solubilité (µM)

Caféine

> 192

Pyrène

<1

Chloramphénicol

> 195

Testostérone

81,2

Colchicine

> 194

Kétoconazole

145,9

Vérapamil

> 192

Trichlorophénol

7,1

Notes

Pour un autre tampon ou une autre température d’incubation, prendre contact.

Pour un seuil de solubilité autre que 200 µM, prendre contact. Dans tous les cas, la proportion finale de DMSO ne dépassera pas les 2%.

Demande de projet
Solubilité thermodynamique

Introduction

Les techniques modernes permettant de découvrir de nouveaux agents thérapeutiques produisent de plus en plus de composés faiblement solubles dans l’eau.

Une faible solubilité limite l’absorption intestinale des composés et de ce fait, leur biodisponiblité dans le cas d’administration orale. Elle pose problème également pour la formulation de solutions injectables par voie intra-veineuse.

Des molécules peu solubles vont aussi affecter les résultats d’analyses réalisées lors de la phase de  "discovery" (ex : problème de précipitation lors de dilutions en série)

Par conséquent, une faible solubilité peut entraîner une perte de temps et des coûts élevés en développement.


•Dans le cas de composés ionisables, la solubilité dépend fortement du pH.

• Une solubilité élevée ne signifie pas nécessairement une bonne absorption intestinale.


Protocole

La solubilité est mesurée par la méthode dite du "flacon agité" : saturation du tampon hepes pH=7,4 puis ultracentrifugation et dosage de la solution saturée.

Incubation : 24h à température ambiante (≈22°C).

Détection HPLC UV-Vis (barrette de diodes).

Détermination de la solubilité à l’aide d’un étalonnage à 3 points (à partir d’une solution de référence dans le DMSO).

Nombre de réplicats = 2


Solubilités à pH=7,4 mesurées à température ambiante


Notes

Pour un autre tampon ou une autre température d’incubation, prendre contact.

La limite minimum de solubilité mesurable dépend de la détection du composé.

Pour les composés très solubles, la limite maximum dépend de la quantité de produit fournie.


Références

A. Avdeef (2007) Advanced Drug Delivery Reviews 59, 568-590

N. Patel (2006) Predictive ADME and Toxicology Strategies

Demande de projet
Stabilité chimique

Introduction

Un composé peut être chimiquement instable s’il est dégradé par des procédés non enzymatiques.

L’instabilité d’un composé en solution peut conduire à des données erronées lors de tests in vitro.

Les composés présentant une instabilité chimique élevée ne peuvent pas prétendre à devenir des candidats médicaments car il est difficile de trouver une formulation permettant de d’empêcher cette dégradation.


• Les composés administrés par voie orale doivent être stables en mileu acide

• Certains composés peuvent se décomposer dans les solvants organiques de stockage (DMSO)


Protocole

La stabilité est généralement déterminée à température ambiante.

Une dilution est réalisée à 20 µM dans un tampon ou un fluide biologique (plasma, sérum) à partir d’une solution stock à 10 mM dans le DMSO.

5 prélèvements sont réalisés à différents temps qui dépendent du milieu (ou 2 prélèvements).

Tampon : 0, 2, 4, 6 et 24h (ou 0 et 24h).

Le pourcentage de composé restant est déterminé par HPLC ou LC-MS en mesurant l’aire sous le pic du composé sur le chromatogramme.

Nombre de réplicats = 2


Stabilité de l’érythromycine à pH 2




Note

Pour d’autres conditions, prendre contact.

Référence

CE. Kibbey et al (2001) Journal of  Pharmaceutical Sciences 90, 1164-1175

Demande de projet
Liaison aux protéines plasmatiques

Introduction

Le plasma contient entre 6 et 8 % de protéines dont l’albumine sérique et l’a-1-glycoprotéine acide.

La liaison aux protéines plasmatiques d’un composé influence sa distribution dans l’organisme Les composés liés sont retenus dans le sang et ne peuvent pas traverser les membranes biologiques.

La liaison aux protéines plasmatiques peut se mesurer par ultrafitration à l’aide d’une membrane semi-perméable.

• La technique d’ultrafiltration est simple, rapide et peu coûteuse.


Protocole

Le composé est dilué à 10 µM dans du plasma.

Un volume du mélange est introduit dans un tube muni d’une membrane avec un "cutoff" de 30 kDa. Le tube est centrifugé à 6000g pendant 25 minutes à température ambiante.

Les molécules non liées traversent la membrane alors que les molécules liées aux protéines sont retenues dans la partie supérieure du tube.

Détection HPLC UV-Vis ou LC-MS

Le pourcentage non lié est calculé à partir de la concentration initiale et de la concentration mesurée dans le compartiment inférieur.

Contrôles : Bilan de matière

Nombre de réplicats = 2


liaisons aux protéines plasmatiques mesurées à 22°C (plasma de souris)

Composé

% lié aux protéines

Composé

% lié aux protéines

Métoprolol

18

Propranolol

90

Piroxicam

98

Quinidine

60


Notes

Pour d’autres conditions, prendre contact.


Référence

J. Oracova et al (1996) Journal of Chromatography B: Biomedical Applications, 677, 1-28


Demande de projet